摘要: 肝脏中的蛋白质只有处于特定的亚细胞中才能发挥其功能。研究特定蛋白质的亚细胞定位对于肝脏功能研究有重要意义1。对于多定位的蛋白质，确定其在不同细胞器中量的变化，也是肝脏蛋白表达谱研究的重要内容之一。目前，蛋白亚细胞定位分析方法主要包括实验方法和理论预测方法两大类。其中实验方法主要有绿色荧光蛋白（GFP）-激光共聚焦显微镜法、免疫电镜胶体金标记法、差速离心-免疫印迹法等。理论预测方法主要根据蛋白质的氨基酸组成、氨基酸对组成以及位置特异性打分矩阵等分类特征，采用模糊k近邻、支持向量机及分组重量编码法等方法进行理论预测。实验方法不仅分析通量低，还需要特异的抗体，并且在定位的同时难以实现定量分析。对于不同的理论预测方法而言，往往会得出不同的结论，准确度差。因而需要建立一种可以实现通量化、准确地进行蛋白亚细胞定位及定量分析的方法。
近年来，质谱多反应监测技术（MRM）在蛋白质定量分析方面的应用越来越广泛²。该技术通过特异性的检测预先设置的母离子和子离子，在母离子和子离子两个水平排除其它离子的检测干扰， 从而增强检测的特异性。同时结合同位素稀释技术可以同时实现对多种目标蛋白质的绝对定量。由于该技术采用特异性检测预设的母子离子对的方法，从而保证了检测的重现性。而依据特定子离子和相应的同位素标记子离子对峰面积进行绝对定量的方法保证了定量的可靠性。同时可以批量化同时进行多个蛋白质的亚细胞定量及定位分析。因而本研究利用MRM技术，用于目标蛋白在肝脏细胞器中定位及定量分析研究。
鉴于本研究样品采用蔗糖密度梯度离心法制备，首先对细胞器样品的分离效果进行评价。选用文献报道³的正向和反向免疫评价抗体蛋白，包括线粒体Marker蛋白COX4、VDAC和Cytc，细胞核Marker蛋白Lamin B，质膜Marker蛋白Na＋K＋-ATPase等。利用MRM技术分析蛋白在不同细胞器样品中的含量，从而对细胞器样品纯度进行评价。同时考察方法的灵敏度，重现性以及动态范围。
在确定了细胞器样品纯度的基础上，利用MRM质谱技术对选定的部分目标蛋白进行了定位分析。根据这些蛋白在不同细胞器样品中的含量，判断其在不同细胞器样品中的定位。并选择其中一些蛋白进行GFP-激光共聚焦显微镜分析，与基于MRM技术的定位分析结果进行对比验证。