摘要: 肝癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，在中国占癌症死亡率的第二位，年死亡率约为20.37/10万¹。肝癌的早期发现是提高疗效延长患者生存时间的关键。寻找和研究特异性强、灵敏度高的肝癌生物标志物蛋白质作为肝癌的早期诊断或预警对于改善肝癌早期诊断率低的状况尤为重要。近几年来，基于质谱技术的蛋白质组学发展加快了生物标志物的研究进程²。采用差异蛋白质组技术，通过比较健康和疾病状况下的蛋白质表达量变化，能获得大量与肝癌发生、发展相关的生物标志物候选蛋白质。然而，从这些候选蛋白质列表中，筛选与疾病发生发展更为密切的生物标志物，确证其在临床检测中的特异性和灵敏度却成为目前生物标志物研究流程中的瓶颈³。传统的生物标志物确证的主要方法是基于免疫学原理的Western-blot和ELISA，由于特异性抗体获取困难制备周期长，使大量生物标志物候选蛋白质确证工作受到限制⁴。而发展基于质谱MRM技术的蛋白质生物标志物候选蛋白质的定量验证策略，不需要进行特异性抗体的合成，为解决验证工作的瓶颈提供了一种新思路⁵。
Vitronectin蛋白和clusterin蛋白在各种恶性肿瘤的发生、发展中起到重要作用，并且也有研究报道认为这两种蛋白质在血清中的表达水平与肝功能受损密切相关。在本研究中，通过采用18O稳定同位素标记方法合成肽段内标并结合MRM质谱检测技术，建立了一种方便快捷的蛋白质绝对定量方法并用于以上两种生物标志物候选蛋白质在肝癌血清中的定量确证。首先针对血清样品干扰组分多和动态范围宽的特点，优化质谱MRM检测条件，引入丙酮沉淀技术改善样品预处理步骤，设计优化的液相色谱分离条件，最终满足了多个血清样本的高通量测定要求。然后，考察了定量方法的可靠性，包括特异性、精密度、准确度、预处理回收率、测定重复性以及定量线性。方法学验证结果显示，在0.4~40 fmol•µL^－1的浓度变化范围内定量测定线性相关性良好，r2值大于0.99。蛋白质最低定量限为0.4 fmol•µL^－1。精密度RSD＜11.96%，准确度RE%＜20%。预处理回收率大于87%，测定重复性RSD＜6.87%。最后，采用建立的方法进行了20例临床血清样本的检测，其中10例健康血清，10例肝癌血清。两组定量数据的统计分析采用非参数统计方法Mann-Whitney检验。在血清样品中测定的vitronectin 和clusterin浓度变化区间分别为 48.28~265.45 mg•L^－1和49.41~136.93 mg•L^－1。统计结果显示两种蛋白质在肝癌组血清样品中浓度呈下调变化（p＝0.049；p＝0.002），为进一步开展大样本的临床验证提供了基础。